EHA101 Chemically Competent Cell  根癌(熱激)感受態(tài)細(xì)胞

基因型：

C58 (rif R) Ti pEHA101 (pTiBo542 D T-DNA) (kanR, strepR)Nopaline

簡要說明：

EHA101菌株為C58型背景，核基因中含有篩選標(biāo)簽——li福平抗性基因rif，為了便于轉(zhuǎn)化操作，此菌株攜帶一無自身轉(zhuǎn)運功能的胭脂堿型Ti質(zhì)粒pEHA101 (pTiBo542DT-DNA)，此質(zhì)粒含有vir基因 (vir基因是T-DNA插入植物基因組必需的元件，pEHA101 (pTiBo542DT-DNA)質(zhì)粒自身的T-DNA轉(zhuǎn)移功能被破壞，但可以幫助轉(zhuǎn)入的雙元載體T-DNA順利轉(zhuǎn)移)。pEHA101(pTiBo542DT-DNA) 型Ti質(zhì)粒含有篩選標(biāo)簽：strep、kan，賦予EHA101菌株lian霉素抗性和ka那霉素抗性，適用于玉米、水稻、煙草等植物的轉(zhuǎn)基因操作，經(jīng)pK7WGF2質(zhì)粒檢測轉(zhuǎn)化效率可達(dá)104 cfu/μg DNA

操作說明：

1.取-80℃保存的農(nóng)桿菌感受態(tài)于冰上待其部分融化，處于冰水混合狀態(tài)時插入冰中。

2.每100μl感受態(tài)加1ug（體積不大于10ul）質(zhì)粒DNA，用手bo打管底混勻，依次于冰上靜置5分鐘、液氮5分鐘、28℃水浴5分鐘、冰浴5分鐘。

3.加入700μl無抗生素的LB或YEB液體培養(yǎng)基，于28℃振蕩培養(yǎng)2~3小時。

4.6000rpm離心一分鐘收菌，留取100μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊涂布于含相應(yīng)抗生素的LB或YEB平板上，倒置放于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2-3天（當(dāng)平板只含有50ug/ml kan 時，28℃培養(yǎng)48h即可；平板中同時加入50ug/ml kan，20ug/ml rif 時，需28℃培養(yǎng)60h；如果使用的平板含有50ug/ml rif 則需要28℃培養(yǎng)72-90h）。

注意事項：

1.加入質(zhì)粒時體積不應(yīng)大于感受態(tài)體積的1/10 ；質(zhì)粒不純或存在乙醇等有機(jī)物污染，轉(zhuǎn)化效率急劇下降；質(zhì)粒增大一倍，轉(zhuǎn)化效率下降一個數(shù)量級。

2.混入質(zhì)粒時應(yīng)輕柔操作。

3.轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?？上鄳?yīng)減少最終用于涂板的菌量。

4.LI福平濃度不應(yīng)高于25ug/ul，過高的LI福平濃度不利于農(nóng)桿菌生長，會降低其生長速度和轉(zhuǎn)化效率。本公司感受態(tài)計算轉(zhuǎn)化效率時所用平板只含有50ug/ml kan，若所用平板含有20ug/ml rif則轉(zhuǎn)化效率降低到1/2。

5.培養(yǎng)基中加入LI福平的目的是防止雜菌生長、篩選農(nóng)桿菌；根據(jù)所用菌株抗性加入LIAN霉素或QING大霉素可防止Ti質(zhì)粒丟失，但LIAN霉素不利于農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)基因操作，所以一般培養(yǎng)農(nóng)桿菌時不考慮LIAN霉素或QING大霉素，Ti質(zhì)粒丟失的概率極低（可以忽略）。